一、支原体检测金标准
根据《中华人民共和国药典》通则3301规定，主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法(又称为DNA染色法)。
因此，培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）也被称为支原体检测的“金标准”，能够检测不同生长特性的支原体，具有广谱性，但敏感性低，耗时长。
二、检测原理及操作方法
1、培养法
培养法即直接取供试品于培养基中进行培养，观察是否有支原体生长。
支原体生长缓慢，种类繁多，生长特性各异。
有的可在营养丰富的培养基上生长，如肺炎支原体。
有的在细胞上生长得更好，如猪鼻支原体。
有的尚不能培养，如植原体。
但由于支原体DNA中编码氨基酸和辅助因子的基因少，缺乏糖异生、三羧酸循环等代谢途径中的许多重要基因，使得支原体生长对营养的需求比一般细菌要高，除需要含有牛肉浸液、酵母浸粉、猪胃消化液、葡萄糖、精氨酸等蛋白胨的基础营养物质外，还需加入10%～20%人或动物血清，用于提供支原体生长、繁殖所需的胆固醇。
药典中推荐使用的培养基：
（1）支原体液体培养基
①支原体肉汤培养基
猪胃消化液 500ml
氯化钠 2.5g
牛肉浸液（1:2） 500ml
葡萄糖 5.0g
酵母浸粉 5.0g
酚红 0.02g
pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。
②精氨酸支原体肉汤培养基
猪胃消化液 500ml
葡萄糖 1.0g
牛肉浸液（1:2） 500ml
L-精氨酸 2.0g
酵母浸粉 5.0g
酚红 0.02g
氯化钠 2.5g
pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。
（2）支原体半流体培养基 按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。
（3）支原体琼脂培养基 按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0-15.0g。
除上述推荐培养基外，亦可使用可支持支原体生长的其他培养基，但灵敏度必须符合要求。
操作方法：
供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8℃；超过24小时应置-20℃以下贮存。
检查支原体采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基（或支原体琼脂培养基）。半流体培养基（或琼脂培养基）在使用应煮沸10～15分钟，冷却至56℃左右，然后加入灭能小牛血清（培养基:血清为8:2），并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用亦应同样补加上述成分。
取每支装量为10ml的支原体液体培养基各4支、相应的支原体半流体培养基各2支（已冷却至36℃±1℃），每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃±1℃培养21天。于接种后的第7天从4支支原体液体培养基中各取2支进行次代培养，每支培养基分别转种至相应的支原体半流体培养基及支原体液体培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察1次。
结果判定：培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格。如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格；如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。
【附注】质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。
2、指示细胞培养法 （DNA染色法）
将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如支原体污染供试品，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。
操作方法：
指示细胞培养法（DNA染色法）是用已被证实无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞作为指示细胞，将待检测细胞（供试品）经无抗菌药物培养液至少传1代，然后取细胞长满，且3天未换液的细胞培养上清液2 mL，加入到有指示细胞的培养孔，孵育3～5天，传代到有盖玻片的6孔培养板培养3～5 天，再用固定液固定，荧光染料（Hoechst33342）染色，通过荧光显微镜观察，阴性对照组仅指示细胞核有荧光染色，支原体污染组可在细胞核或细胞周围观察到大小不等、不规则的荧光着色颗粒，或丝状的荧光带。
供试品处理：将供试品经无抗生素培养液至少传一代，然后取细胞已长满且3天未换液的细胞培养上清液待检。用无抗生素培养基2ml替代供试品，同法操作，作为阴性对照。用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品，同法操作，作为阳性对照。
于制备好的指示细胞培养板中加入准备好的供试品（细胞培养上清液）2ml（毒种或其他供试品至少1ml），置5%二氧化碳孵箱36℃±1℃培养3～5天。
指示细胞培养物至少传代1次，末次传代培养用含盖玻片的6孔细胞培养板培养3～5天后，吸出培养孔中的培养液，加入固定液5ml，放置5分钟，吸出固定液，再加5ml固定液固定10分钟，再次吸出固定液，使盖玻片在空气中干燥。
加二苯甲酰胺荧光染料（或其他DNA染料）工作液5ml，加盖，室温放置30分钟，吸出染液，每孔用水5ml洗3次，吸出水，盖玻片于空气中干燥。
取洁净载玻片加封片液1滴，分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。
用荧光显微镜观察。
结果判定：
①阴性对照：仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。
②阳性对照：荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。
③当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。
④如供试品结果为阴性，则供试品判为合格；如供试品结果为阳性或可疑时，应进行重试；如仍阳性时，供试品判为不合格。
总结
培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）是支原体检测的“金标准”，但这两种方法都具有检测时间长的特点。
为了解决这一痛点，各品牌也推出了各种进行快速检测的支原体检测试剂盒，方便日常实验室进行即时检测。如显色法、化学发光法和PCR法等。
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